LAPORAN BIOTEKNOLOGI (ISOLASI DNA)
LAPORAN PENGANTAR
BIOTEKNOLOGI
ISOLASI
DNA
OLEH:
NAMA
:NUR APRIANY D
NIM :
1214041003
KELOMPOK
I
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU
PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI MAKASSAR
2015
HALAMAN PENGESAHAN
Laporan lengkap praktikum Pengantar
Bioteknogi dengan judul “Isolasi DNA”
yang disusun oleh:
Nama : Nur Apriany D
NIM : 1214041003
Kelompok : I (Satu)
telah diperiksa oleh Asisten/Koordinator Asisten,
sehingga dinyatakan dapat
diterima.
Makassar, Desember 2015
Koordinator
Asisten Asisten
Muhammad Dwi Prasetyo Nasrah
NIM: 101414041 NIM:
1214141018
Mengetahui
Dosen Penanggung Jawab
Prof. Dr. Ir. Hj. Yusminah
Hala, M.S
NIP: 19611212 198601 2 002
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Molekul
DNA, yang merupakan unit terkecil di dalam sel dan merupakan komponen penentu kehidupan
dengan berbagai keragamannya, dapat diisolasi, dimanipulasi serta dipindahkan
dari satu organisme ke organisme lain. Penggunaan teknik isolasi DNA dalam
berbagai bidang semakin meluas sejalan
dengan kemajuan bioteknologi. Bioteknologi modern diartikan sebagai teknologi
rekayasa genetika yang bermain pada level molekuler khususnya DNA. Isolasi DNA
merupakan teknik awal untuk berbagai tujuan seperti tanaman transgenik, DNA
rekombinan, kloning DNA, proyek genom manusia, deteksi penyakit keturunan,
pemetaan sidik jari forensik, penentuan jenis kelamin dan lain-lain.
Ekstraksi
DNA dari organisme eukariot dilakukan melalui penghancuran dinding sel,
penghilangan protein dan RNA, pengendapan DNA dan pemanenan DNA. Secara
kimiawi, penghancuran sel dilakukan dengan memanfaatkan senyawa kimia yang
berfungsi merusak membran sel dan enzim protease yang digunakan untuk menghancurkan
protein serta membersihkan kotoran akibat lisis sel.
Isolasi
DNA membutuhkan alat-alat yang canggih dan bahan-bahan yang harganya cukup
mahal seperti etilendiamin tetraaasetat (EDTA), sodium dodesil sulfat (SDS), enzim proteinase K,
RNAse, NaCl, phenol dan chloroform. Namun, secara sederhana dapat
digunakan teknik isolasi DNA metode Kitchen preparation yaitu suatu
teknik isolasi DNA yang menggunakan alat-alat yang sederhana dan bahan-bahan
rumah tangga yang mudah didapat serta murah harganya. Misalnya deterjen sebagai
pengganti EDTA dan SDS, garam dapur sebagai pengganti NaCl analitik, dan jus
nanas sebagai pengganti enzim proteinase K. Metode kitchen terdiri dari
beberapa tahapan. Oleh karena itu, elalui praktikum ini akan dipelajari
bagaimana cara melakukan isolasi DNA dengan menggunakan metode kitchen.
B. Tujuan Praktikum
Tujuan
dari pelaksanaan praktikum ini, yaitu untuk mengetahui bagaimana cara
mengisolasi DNA dengan menggunakan metode kitchen.
C. Manfaat Praktikum
Manfaat
dari pelaksanaan praktikum ini, yaitu dapat meengisolasi DNA dari beberapa
tanaman dengan menggunakan metode kitchen.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Biologi Sel dan Molekuler merupakan bidang ilmu yang
terus menerus berkembang. Ilmu ini bermanfaat hampir di semua bidang. Baik
dalam bidang medis untuk menangani kelainan-kelainan genetik dan penemuan
obat-obat baru, pada bidang pertanian, peternakan, kehutanan untuk meningkatkan
produk-produk baik tanaman maupun hewan unggul maupun di bidang lingkungan
dalam hal mengatasi polutan serta perannya dalam kemajuan produksi pangan. Isolasi DNA merupakan teknik yang penting
dalam pengembangan ilmu ini. Derajat kemurnian dan kualitas dalam isolasi DNA
sangat mempengaruhi hasil yang akan diperoleh. Secara umum, prosedur ekstraksi
yang baik untuk isolasi DNA mencakup tiga hal penting, yaitu harus bisa dihasilkan
DNA dengan kemurnian yang tinggi, DNAnya harus utuh, dan jumlahnya mencukupi
(konsentrasi tinggi)
Kualitas DNA yang baik yang diperoleh dari hasil
ekstraksi merupakan syarat dasar yang harus dipenuhi dalam studi molekuler,
terutama dalam penandaan sidik jari DNA. Cetyl Trimethyl Ammonium
Bromide (CTAB) merupakan metode yang umum digunakan dalam ekstraksi DNA
tanaman yang banyak mengandung polisakarida dan senyawa polifenol. Ada tiga
langkah utama dalam ekstraksi DNA, yaitu perusakan dinding sel (lisis),
pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian
DNA
Isolasi DNA dapat dilakukan dari berbagai sumber,
antara lain organ manusia, darah, daun, daging buah, serangga, kalus, akar
batang, daging dan sisik ikan. Pada individu yang sama DNA yang diperoleh dari
berbagai sumber akan memiliki jenis jumlah dan ukuran yang sama. DNA yang
diisolasi dari tanaman seringkali terkontaminasi oleh polisakarida dan
metabolit sekunder seperti tanin, pigmen, alkaloid dan flavonoid. Sedangkan DNA
dari hewan lebih banyak mengandung protein. Salah satu kesulitan isolasi DNA
dari tanaman tinggi adalah proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi
sel. Hal ini disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat dan
seringkali pada beberapa jenis tanaman, kontaminasi tersebut sulit dipisahkan
dari ekstrak asam nukleat. Kehadiran kontaminasi di atas dapat menghambat
aktivitas enzim, misalnya DNA tidak sensitif oleh enzim restriksi dan menggangu
proses amplifikasi DNA dengan PCR. Demikian pula pada hewan yang memiliki
kandungan kitin (seperti serangga), memerlukan teknik dan metode khusus untuk
menghancurkan sel hingga isi dapat terpisah atau keluar dari sel
Isolasi DNA merupakan langkah awal prosedur kerja dalam genetika
molekuler. Prosedur ekstraksi DNA dari jaringan tanaman, pertama diawali dengan
penghancuran dinding sel untuk mengeluarkan isi sel. Cara yang lazim dilakukan
untuk menghancurkan jaringan tanaman adalah dengan membuat sel-sel dalam
keadaan dehidrasi atau dengan membekukan jaringan tanaman segar menggunakan es
kering atau nitrogen cair. Jaringan yang sudah getas ini kemudian digerus
sampai menjadi serbuk. Selanjutnya DNA harus dipisahkan dari isi sel yang
lainnya agara bercampur dengan bufer ekstraksi. Hal ini umum dilakukan dengan
menggunakan deterjen. Tahap akhir, DNA harus dimurnikan dari senyawa-senyawa
non-DNA lainnya, seperti RNA, protein, polisakarida, metabolit sekunder, dan
sebagainya
Bahan-bahan yang digunakan untuk isolasi DNA terdapat dalam buffer
isolasi yang dapat menjaga struktur DNA selama pemecahan sel dan purifiikasi,
memfasilitasi isolasi DNA sehingga mudah untuk menghilangkan protein dan RNA,
menghambat enzim mendegradasi DNA yang ada di dalam sel dan menjaga perubahan
kimiawi molekul DNA oleh komponen-komponen cair dalam sel yang dilepaskan pada
saat sel dipecah. Konsentrasi buffer, pH, kekuatan ionik, penambahan penghambat
Dnase dan detergen dapat memenuhi semua kebutuhan di atas
Ekstraksi DNA bertujuan untuk memisahkan DNA dengan partikel lain yang
tidak diinginkan. Proses ini harus dilakukan dengan hati-hati, sehingga tidak
menyebabkan kerusakan pada DNA. Untuk mengeluarkan DNA dari sel, dapat
dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik
dengan cara mekanik maupun secara kimiawi. Cara mekanik bisa dilakukan dengan
pemblenderan atau penggerusan menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara
kimiawi penghancuran sel dilakukan dengan memanfaatkan senyawa kimia seperti
EDTA dan SDS
Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat dilakukan karena deterjen
dapat menyebabkan rusaknya membran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui
sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membran membentuk
senyawa ”lipid protein-deterjen kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk
karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian
juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia. Garam ini
dibutuhkan untuk menjaga struktur molekul DNA dan mengurangi jumlah air yang
ada pada fase fenol, dan memfasilitasi deproteinisasi. NaCl berfungsi untuk
menjaga asam nukleat tetap berada pada medium isotonik. Konsentrasi garam ini
diperlukan untuk menjaga struktur molekul DNA
Menurut Yulianti (2006), Secara umum prosedur ekstraksi untuk isolasi DNA
harus memenuhi tiga kriteria utama:
1. Harus
bisa menghasilkan DNA yang murni, untuk penggunaan selanjutnya. Misalnya untuk
analisa RFLP, harus digunakan DNA yang cukup murni untuk bisa dipotong oleh restriction
endonuclease dan ditransfer ke membrane untuk analisis Southern. Untuk
analisis polymerase chain reaction (PCR) ekstrak DNA harus tidak
mengandung kontaminan DNA yang dapat mengganggu PCR.
2. DNA
harus utuh untuk memberikan pola migrasi yang akurat pada gel
electriphoresis.
3. DNA
yang dihasilkan harus mencukupi.
4. Prosedur
yang digunakan harus cepat, sederhana dan murah, dan jika memungkinkan bisa
dihindari penggunaan bahan kimia yang berbahaya.
BAB III
METODE PRAKTIKUM
A. Waktu dan Tempat
Hari/ Tanggal : Selasa/ 8 Desember 2015
Waktu :
07.30-09.30 WITA
Tempat : Laboratorium Biologi Lantai
II Barat FMIPA UNM
B. Alat dan Bahan
1.
Alat
a.
Tabung Reaksi
b.
Pisau
c.
Pipet Tetes
d.
Mortal
e.
Gelas Beker 250 ml
f.
Gelas Ukur 10 ml
g.
Kertas Saring
h.
Neraca Analitik
2.
Bahan
a.
Tumbuhan (buah mangga, pepaya, mentimun,
apel, lidah buaya, cocor bebek, pisang, dan tomat)
b.
NaCl 3 gram
c.
Deterjen
d.
Ethanol 95-100% dingin.
C. Cara Kerja
1.
Mengupas kulit buah dan memotong daging
buah.
2.
Menimbang buah 15-20 gram.
3.
Menyimpan buah di dalam beker.
4.
Melarutkan 3 gram NaCl di dalam aquades
5 ml dan menambahkan deterjen secukupnya.
5.
Menuang 95 ml aquades agar volume
mencukupi 100 ml
6.
Menggerus buah dan menyimpan cairan
tersebut ke dalam tabung reaksi sebanyak 6 ml.
7. Menambahkan etanol pada tabung reaksi
dan menunggu hingga beberapa menit sehingga terbentuk 2 lapisan.
8.
Mengamati warna dan bentuknya.
BAB
IV
HASIL
DAN PEMBAHASAN
A. Hasil Pengamatan
Tabel 4. 1 Hasil
Pengamatan
No |
Sampel |
Hasil
Pengamatan |
||
Warna |
Bentuk |
Waktu
(S) |
||
1 |
Pepaya |
Orange |
Spindel |
44 |
2 |
Mangga |
Kuning
Pucat |
Spindel |
360 |
3 |
Lidah Buaya |
Putih |
Spindel |
1440 |
4 |
Cocor
Bebek |
Putih |
Spindel |
913 |
5 |
Apel |
Putih |
Spindel |
13500 |
6 |
Mentimun |
Putih |
Spindel |
1560 |
7 |
Tomat |
Putih |
Spindel |
420 |
8 |
Pisang |
Putih |
Spindel |
99 |
B. Pembahasan
Isolasi
DNA merupakan langkah awal prosedur kerja dalam genetika molekuler. Isolasi DNA
pada dasarnya dapat dilakukan dengan menggunakan berbagai macam sumber DNA yang
dapat diperoleh dari hewan maupun tumbuhan. Namun, pada kegiatan praktikum ini
sumber DNA yang digunakan berasal dari tumbuhan, yaitu pepaya, mangga, lidah
buaya, cocor bebek, apel, mentimun, tomat, dan pisang. Metode yang digunakan di
dalam isolasi DNA yang digunakan adalah metode kitchen. Disebut metode kitchen
karena alat dan bahan yang digunakan biasa digunakan di dalam kegiatan
sehari-hari.
Langkah
pertama yang harus dilakukan yaitu ekstraksi DNA. Ekstraksi DNA yang dilakukan
pada kegiatan praktikum ini dilakukan dengan cara mekanik dan kimiawi. Secara
mekanik dilakukan dengan penggerusan dan secara kimiawai dilakukan dengan
menggunakan deterjen dan NaCl. Tujuan pemberian deterjen yaitu untuk merusak
dinding sel tumbuhan yang digunakan. Selain itu, di dalam deterjen terdapat
kandungang ETDA. EDTA di sini akan mengikat ionion logam yang merupakan
kofaktor DNase dan protein lain yang dapat mendegradasi DNA. Hydranate akan
berikatan dengan protein dan memisahkannya dari DNA dengan kekuatan ionik.
Secara bersamaan bahan-bahan ini akan memisahkan protein dari DNA dan
melindungi DNA dari kerusakan Sedangkan, NaCl dibutuhkan untuk menjaga struktur
DNA.
Hal
ini sesuai dengan penjelasan Mardiyyaningsih (2013), yaitu penambahan deterjen
dalam isolasi DNA dapat dilakukan karena deterjen dapat menyebabkan rusaknya
membran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen
dengan protein dan lemak pada membran membentuk senyawa “lipid protein-deterjen
kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki
ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat
membentuk suatu ikatan kimia.
Garam
ini dibutuhkan untuk menjaga struktur molekul DNA dan mengurangi
jumlah air yang ada pada fase fenol, dan memfasilitasi deproteinisasi.
NaCl berfungsi untuk menjaga asam nukleat tetap berada pada medium isotonik.
Konsentrasi garam ini diperlukan untuk menjaga struktur molekul DNA.
Selanjutnya,
DNA hasil ekstraksi dipisahkan dengan kompenen sel lainnya dengan menggunakan
etanol 95% yang telah didinginkan. Dengan adanya penambahan etanol maka
komponen polisakarida akan mengendap di dasar tabung. Selain itu, etanol juga
berfungsi untuk merenaturasi ikatan hidrogen pada DNA dan melarutkan pengotor
seperti protein dan senyawa metabolit sekunder lainnya.
Berdasarkan
hasil pengamatan, terlihat bahwa warna dan waktu yang diperlukan hingga
terbentuk spindel DNA membutuhkan waktu yang berbeda-beda. Untuk warna sendiri
dipengaruhi oleh jenis zat warna yang terdapat di dalam air. Sedangkan, untuk
waktu yang diperlukan disebabkan karena kandungan enzim yang terdapat di dalam
bahan yang digunakan berbeda-beda. Enzim yang dimaksud yaitu enzim protease.
Enzim protease merupakan enzim yang biasa ditemukan di dalam buah-buahan. Dari
delapan bahan yang digunakan kandungan enzim protease terbanyak terdapat pada
pepaya. Hal ini terlihat dari waktu yang digunakan sangat singkat, yaitu hanya
44 detik.
Enzim
protease Proteinase berfungsi memecah ikatan peptide pada sisi karboksil dari
asam amino alifatik, hidrofobik atau aromatik. Proteinase K digunakan untuk
pencernaan protein pada bagian jaringan sebagai perlakuan awal pada preparasi
DNA dan RNA serta untuk menginaktivasi aktivitas enzimatik protein lain. Enzim
ini dengan cepat dapat menginaktivasi nuklease, RNase dan DNase
BAB V
PENUTUP
A.
Kesimpulan
Berdasarkan
kegiatan praktikum yang dilakukan, metode kitchen merupakan metode isolasi DNA
dengan menggunakan alat dan bahan yang biasa digunakan di dalam kehidupan
sehari-hari. Langkah pertama isolasi DNA yaitu ekstraksi DNA yang dilakukan
dengan menggunakan cara mekanik yaitu penggerusan dan secara kimiawi dengan
menggunakan deterjen dan NaCl untuk memisahkan DNA dari komponen sel lainnya.
Selanjutnya, DNA hasil ekstraksi dipisahkan dengan kompenen sel lainnya dengan
menggunakan etanol 95% yang telah didinginkan. Dengan adanya penambahan etanol
maka komponen polisakarida akan mengendap di dasar tabung.
B.
Saran
Adapun
saran untuk kegiatan praktikum ini, yaitu seharusnya lebih teliti di dalam
melakukan praktikum ini, khususnya saat mengamati waktu terbentuknya spindel
DNA.
DAFTAR PUSTAKA
Hala, Y., & Hartono. (2015). Penuntun Pengantar
Bioteknologi. Makassar: Universitas Negeri Makassar.
Kusumawaty, D. (2010, Maret 24). Isolasi DNA skala kecil.
Dipetik Desember 14, 2015, dari File UPI: http://file.upi.edu
Mardiyyaningsih, A. N. (2013). Teknik Isolasi DNA dari Sel
Hati Ayam Secara Tradisional. Pontianak: Universitas Tanjung Pura.
Maryam, S. (2009). Ektrak Enzim Bromelin dari Buah Nanas
(Ananas Sativus) dan Pemanfaatannya dalam Isolasi DNA. Semarang: Universitas
Negeri Semarang.
Syafaruddin, Randriani, E., & Santoso, T. J. (2011).
Efektivitas dan Efisiensi Teknik Isolasi dan Purifikasi DNA pada Jambu Mete. Buletin
RISTRI, II(2), 151-160.
Yulianti, E. (2006). Pengembangan Teknik Isolasi DNA
Tumbuhan dengan Menggunakan Deterjen Komersial. Yogyakarta: Universitas
Negeri Yogyakarta.
Komentar
Posting Komentar