LAPORAN BIOTEKNOLOGI (ISOLASI DNA)

 

LAPORAN PENGANTAR BIOTEKNOLOGI

 

 

ISOLASI DNA

 

 

 

 

 

 

 


OLEH:

NAMA :NUR APRIANY D

NIM : 1214041003

KELOMPOK I

 

 

 

 

 

 

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS NEGERI MAKASSAR

2015

 

HALAMAN PENGESAHAN

 

Laporan lengkap praktikum Pengantar Bioteknogi dengan judul “Isolasi DNA” yang disusun oleh:

Nama               : Nur Apriany D

NIM                : 1214041003

Kelompok        : I (Satu)

telah diperiksa oleh Asisten/Koordinator Asisten, sehingga dinyatakan dapat                   diterima.

                                                                                               

Makassar,   Desember 2015

Koordinator Asisten                                                   Asisten

 

 

Muhammad Dwi Prasetyo                                       Nasrah

NIM: 101414041                                                      NIM: 1214141018                                                                                                                                                

                                                                       

 

Mengetahui

Dosen Penanggung Jawab

 

 

Prof. Dr. Ir. Hj. Yusminah Hala, M.S

NIP: 19611212 198601 2 002

BAB I

PENDAHULUAN

 

 

A.  Latar Belakang

Molekul DNA, yang merupakan unit terkecil di dalam sel dan merupakan komponen penentu kehidupan dengan berbagai keragamannya, dapat diisolasi, dimanipulasi serta dipindahkan dari satu organisme ke organisme lain. Penggunaan teknik isolasi DNA dalam berbagai bidang semakin meluas  sejalan dengan kemajuan bioteknologi. Bioteknologi modern diartikan sebagai teknologi rekayasa genetika yang bermain pada level molekuler khususnya DNA. Isolasi DNA merupakan teknik awal untuk berbagai tujuan seperti tanaman transgenik, DNA rekombinan, kloning DNA, proyek genom manusia, deteksi penyakit keturunan, pemetaan sidik jari forensik, penentuan jenis kelamin dan lain-lain.

Ekstraksi DNA dari organisme eukariot dilakukan melalui penghancuran dinding sel, penghilangan protein dan RNA, pengendapan DNA dan pemanenan DNA. Secara kimiawi, penghancuran sel dilakukan dengan memanfaatkan senyawa kimia yang berfungsi merusak membran sel dan enzim protease yang digunakan untuk menghancurkan protein serta membersihkan kotoran akibat lisis sel.

Isolasi DNA membutuhkan alat-alat yang canggih dan bahan-bahan yang harganya cukup mahal seperti etilendiamin tetraaasetat (EDTA), sodium  dodesil sulfat (SDS), enzim proteinase K, RNAse, NaCl, phenol dan chloroform. Namun, secara sederhana dapat digunakan teknik isolasi DNA metode Kitchen preparation yaitu suatu teknik isolasi DNA yang menggunakan alat-alat yang sederhana dan bahan-bahan rumah tangga yang mudah didapat serta murah harganya. Misalnya deterjen sebagai pengganti EDTA dan SDS, garam dapur sebagai pengganti NaCl analitik, dan jus nanas sebagai pengganti enzim proteinase K. Metode kitchen terdiri dari beberapa tahapan. Oleh karena itu, elalui praktikum ini akan dipelajari bagaimana cara melakukan isolasi DNA dengan menggunakan metode kitchen.

B.  Tujuan Praktikum

Tujuan dari pelaksanaan praktikum ini, yaitu untuk mengetahui bagaimana cara mengisolasi DNA dengan menggunakan metode kitchen.

C.  Manfaat Praktikum

Manfaat dari pelaksanaan praktikum ini, yaitu dapat meengisolasi DNA dari beberapa tanaman dengan menggunakan metode kitchen.


BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

 

 

Biologi Sel dan Molekuler merupakan bidang ilmu yang terus menerus berkembang. Ilmu ini bermanfaat hampir di semua bidang. Baik dalam bidang medis untuk menangani kelainan-kelainan genetik dan penemuan obat-obat baru, pada bidang pertanian, peternakan, kehutanan untuk meningkatkan produk-produk baik tanaman maupun hewan unggul maupun di bidang lingkungan dalam hal mengatasi polutan serta perannya dalam kemajuan produksi pangan.  Isolasi DNA merupakan teknik yang penting dalam pengembangan ilmu ini. Derajat kemurnian dan kualitas dalam isolasi DNA sangat mempengaruhi hasil yang akan diperoleh. Secara umum, prosedur ekstraksi yang baik untuk isolasi DNA mencakup tiga hal penting, yaitu harus bisa dihasilkan DNA dengan kemurnian yang tinggi, DNAnya harus utuh, dan jumlahnya mencukupi (konsentrasi tinggi) (Yulianti, 2006). 

Kualitas DNA yang baik yang diperoleh dari hasil ekstraksi merupakan syarat dasar yang harus dipenuhi dalam studi molekuler, terutama dalam penandaan sidik jari DNA. Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) merupakan metode yang umum digunakan dalam ekstraksi DNA tanaman yang banyak mengandung polisakarida dan senyawa polifenol. Ada tiga langkah utama dalam ekstraksi DNA, yaitu perusakan dinding sel (lisis), pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA (Syafaruddin, Randriani, & Santoso, 2011).

Isolasi DNA dapat dilakukan dari berbagai sumber, antara lain organ manusia, darah, daun, daging buah, serangga, kalus, akar batang, daging dan sisik ikan. Pada individu yang sama DNA yang diperoleh dari berbagai sumber akan memiliki jenis jumlah dan ukuran yang sama. DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontaminasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder seperti tanin, pigmen, alkaloid dan flavonoid. Sedangkan DNA dari hewan lebih banyak mengandung protein. Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat dan seringkali pada beberapa jenis tanaman, kontaminasi tersebut sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat. Kehadiran kontaminasi di atas dapat menghambat aktivitas enzim, misalnya DNA tidak sensitif oleh enzim restriksi dan menggangu proses amplifikasi DNA dengan PCR. Demikian pula pada hewan yang memiliki kandungan kitin (seperti serangga), memerlukan teknik dan metode khusus untuk menghancurkan sel hingga isi dapat terpisah atau keluar dari sel (Kusumawaty, 2010).

Isolasi DNA merupakan langkah awal prosedur kerja dalam genetika molekuler. Prosedur ekstraksi DNA dari jaringan tanaman, pertama diawali dengan penghancuran dinding sel untuk mengeluarkan isi sel. Cara yang lazim dilakukan untuk menghancurkan jaringan tanaman adalah dengan membuat sel-sel dalam keadaan dehidrasi atau dengan membekukan jaringan tanaman segar menggunakan es kering atau nitrogen cair. Jaringan yang sudah getas ini kemudian digerus sampai menjadi serbuk. Selanjutnya DNA harus dipisahkan dari isi sel yang lainnya agara bercampur dengan bufer ekstraksi. Hal ini umum dilakukan dengan menggunakan deterjen. Tahap akhir, DNA harus dimurnikan dari senyawa-senyawa non-DNA lainnya, seperti RNA, protein, polisakarida, metabolit sekunder, dan sebagainya (Hala & Hartono, 2015).

Bahan-bahan yang digunakan untuk isolasi DNA terdapat dalam buffer isolasi yang dapat menjaga struktur DNA selama pemecahan sel dan purifiikasi, memfasilitasi isolasi DNA sehingga mudah untuk menghilangkan protein dan RNA, menghambat enzim mendegradasi DNA yang ada di dalam sel dan menjaga perubahan kimiawi molekul DNA oleh komponen-komponen cair dalam sel yang dilepaskan pada saat sel dipecah. Konsentrasi buffer, pH, kekuatan ionik, penambahan penghambat Dnase dan detergen dapat memenuhi semua kebutuhan di atas (Yulianti, 2006).

Ekstraksi DNA bertujuan untuk memisahkan DNA dengan partikel lain yang tidak diinginkan. Proses ini harus dilakukan dengan hati-hati, sehingga tidak menyebabkan kerusakan pada DNA. Untuk mengeluarkan DNA dari sel, dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik dengan cara mekanik maupun secara kimiawi. Cara mekanik bisa dilakukan dengan pemblenderan atau penggerusan menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi penghancuran sel dilakukan dengan memanfaatkan senyawa kimia seperti EDTA dan SDS (Maryam, 2009).

Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat dilakukan karena deterjen dapat menyebabkan rusaknya membran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membran membentuk senyawa ”lipid protein-deterjen kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia. Garam ini dibutuhkan untuk menjaga struktur molekul DNA dan mengurangi jumlah air yang ada pada fase fenol, dan memfasilitasi deproteinisasi. NaCl berfungsi untuk menjaga asam nukleat tetap berada pada medium isotonik. Konsentrasi garam ini diperlukan untuk menjaga struktur molekul DNA (Mardiyyaningsih, 2013).

Menurut Yulianti (2006), Secara umum prosedur ekstraksi untuk isolasi DNA harus memenuhi tiga kriteria utama:

1.      Harus bisa menghasilkan DNA yang murni, untuk penggunaan selanjutnya. Misalnya untuk analisa RFLP, harus digunakan DNA yang cukup murni untuk bisa dipotong oleh restriction endonuclease dan ditransfer ke membrane untuk analisis Southern. Untuk analisis polymerase chain reaction (PCR) ekstrak DNA harus tidak mengandung kontaminan DNA yang dapat mengganggu PCR.

2.      DNA harus utuh untuk memberikan pola migrasi yang akurat pada gel electriphoresis.

3.      DNA yang dihasilkan harus mencukupi.

4.      Prosedur yang digunakan harus cepat, sederhana dan murah, dan jika memungkinkan bisa dihindari penggunaan bahan kimia yang berbahaya.

 

BAB III

METODE PRAKTIKUM

 

 

A.  Waktu dan Tempat

Hari/ Tanggal          : Selasa/ 8 Desember 2015

Waktu                     : 07.30-09.30 WITA

Tempat                   : Laboratorium Biologi Lantai II Barat FMIPA UNM

B.  Alat dan Bahan

1.      Alat

a.      Tabung Reaksi

b.      Pisau

c.      Pipet Tetes

d.     Mortal

e.      Gelas Beker 250 ml

f.       Gelas Ukur 10 ml

g.      Kertas Saring

h.      Neraca Analitik

2.      Bahan

a.      Tumbuhan (buah mangga, pepaya, mentimun, apel, lidah buaya, cocor bebek, pisang, dan tomat)

b.      NaCl 3 gram

c.      Deterjen

d.     Ethanol 95-100% dingin.

C.  Cara Kerja

1.      Mengupas kulit buah dan memotong daging buah.

2.      Menimbang buah 15-20 gram.

3.      Menyimpan buah di dalam beker.

4.      Melarutkan 3 gram NaCl di dalam aquades 5 ml dan menambahkan deterjen secukupnya.

5.      Menuang 95 ml aquades agar volume mencukupi 100 ml

6.      Menggerus buah dan menyimpan cairan tersebut ke dalam tabung reaksi sebanyak 6 ml.

7.  Menambahkan etanol pada tabung reaksi dan menunggu hingga beberapa menit sehingga terbentuk 2 lapisan.

8.      Mengamati warna dan bentuknya.

 

 

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

 

 

A.  Hasil Pengamatan

Tabel 4. 1 Hasil Pengamatan

No

Sampel

Hasil Pengamatan

Warna

Bentuk

Waktu (S)

1

Pepaya

Orange

Spindel

44

2

Mangga

Kuning Pucat

Spindel

360

3

Lidah Buaya

Putih

Spindel

1440

4

Cocor Bebek

Putih

Spindel

913

5

Apel

Putih

Spindel

13500

6

Mentimun

Putih

Spindel

1560

7

Tomat

Putih

Spindel

420

8

Pisang

Putih

Spindel

99

 

B.  Pembahasan

Isolasi DNA merupakan langkah awal prosedur kerja dalam genetika molekuler. Isolasi DNA pada dasarnya dapat dilakukan dengan menggunakan berbagai macam sumber DNA yang dapat diperoleh dari hewan maupun tumbuhan. Namun, pada kegiatan praktikum ini sumber DNA yang digunakan berasal dari tumbuhan, yaitu pepaya, mangga, lidah buaya, cocor bebek, apel, mentimun, tomat, dan pisang. Metode yang digunakan di dalam isolasi DNA yang digunakan adalah metode kitchen. Disebut metode kitchen karena alat dan bahan yang digunakan biasa digunakan di dalam kegiatan sehari-hari.

Langkah pertama yang harus dilakukan yaitu ekstraksi DNA. Ekstraksi DNA yang dilakukan pada kegiatan praktikum ini dilakukan dengan cara mekanik dan kimiawi. Secara mekanik dilakukan dengan penggerusan dan secara kimiawai dilakukan dengan menggunakan deterjen dan NaCl. Tujuan pemberian deterjen yaitu untuk merusak dinding sel tumbuhan yang digunakan. Selain itu, di dalam deterjen terdapat kandungang ETDA. EDTA di sini akan mengikat ionion logam yang merupakan kofaktor DNase dan protein lain yang dapat mendegradasi DNA. Hydranate akan berikatan dengan protein dan memisahkannya dari DNA dengan kekuatan ionik. Secara bersamaan bahan-bahan ini akan memisahkan protein dari DNA dan melindungi DNA dari kerusakan Sedangkan, NaCl dibutuhkan untuk menjaga struktur DNA.

Hal ini sesuai dengan penjelasan Mardiyyaningsih (2013), yaitu penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat dilakukan karena deterjen dapat menyebabkan rusaknya membran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membran membentuk senyawa “lipid protein-deterjen kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia. Garam ini dibutuhkan untuk menjaga struktur molekul DNA dan mengurangi jumlah air yang ada pada fase fenol, dan memfasilitasi deproteinisasi. NaCl berfungsi untuk menjaga asam nukleat tetap berada pada medium isotonik. Konsentrasi garam ini diperlukan untuk menjaga struktur molekul DNA.

Selanjutnya, DNA hasil ekstraksi dipisahkan dengan kompenen sel lainnya dengan menggunakan etanol 95% yang telah didinginkan. Dengan adanya penambahan etanol maka komponen polisakarida akan mengendap di dasar tabung. Selain itu, etanol juga berfungsi untuk merenaturasi ikatan hidrogen pada DNA dan melarutkan pengotor seperti protein dan senyawa metabolit sekunder lainnya.

Berdasarkan hasil pengamatan, terlihat bahwa warna dan waktu yang diperlukan hingga terbentuk spindel DNA membutuhkan waktu yang berbeda-beda. Untuk warna sendiri dipengaruhi oleh jenis zat warna yang terdapat di dalam air. Sedangkan, untuk waktu yang diperlukan disebabkan karena kandungan enzim yang terdapat di dalam bahan yang digunakan berbeda-beda. Enzim yang dimaksud yaitu enzim protease. Enzim protease merupakan enzim yang biasa ditemukan di dalam buah-buahan. Dari delapan bahan yang digunakan kandungan enzim protease terbanyak terdapat pada pepaya. Hal ini terlihat dari waktu yang digunakan sangat singkat, yaitu hanya 44 detik.

Enzim protease Proteinase berfungsi memecah ikatan peptide pada sisi karboksil dari asam amino alifatik, hidrofobik atau aromatik. Proteinase K digunakan untuk pencernaan protein pada bagian jaringan sebagai perlakuan awal pada preparasi DNA dan RNA serta untuk menginaktivasi aktivitas enzimatik protein lain. Enzim ini dengan cepat dapat menginaktivasi nuklease, RNase dan DNase (Maryam, 2009).

 

 

 

BAB V

PENUTUP

 

 

 

A.    Kesimpulan

Berdasarkan kegiatan praktikum yang dilakukan, metode kitchen merupakan metode isolasi DNA dengan menggunakan alat dan bahan yang biasa digunakan di dalam kehidupan sehari-hari. Langkah pertama isolasi DNA yaitu ekstraksi DNA yang dilakukan dengan menggunakan cara mekanik yaitu penggerusan dan secara kimiawi dengan menggunakan deterjen dan NaCl untuk memisahkan DNA dari komponen sel lainnya. Selanjutnya, DNA hasil ekstraksi dipisahkan dengan kompenen sel lainnya dengan menggunakan etanol 95% yang telah didinginkan. Dengan adanya penambahan etanol maka komponen polisakarida akan mengendap di dasar tabung.

B.     Saran

Adapun saran untuk kegiatan praktikum ini, yaitu seharusnya lebih teliti di dalam melakukan praktikum ini, khususnya saat mengamati waktu terbentuknya spindel DNA.

 

DAFTAR PUSTAKA

 

 

Hala, Y., & Hartono. (2015). Penuntun Pengantar Bioteknologi. Makassar: Universitas Negeri Makassar.

Kusumawaty, D. (2010, Maret 24). Isolasi DNA skala kecil. Dipetik Desember 14, 2015, dari File UPI: http://file.upi.edu

Mardiyyaningsih, A. N. (2013). Teknik Isolasi DNA dari Sel Hati Ayam Secara Tradisional. Pontianak: Universitas Tanjung Pura.

Maryam, S. (2009). Ektrak Enzim Bromelin dari Buah Nanas (Ananas Sativus) dan Pemanfaatannya dalam Isolasi DNA. Semarang: Universitas Negeri Semarang.

Syafaruddin, Randriani, E., & Santoso, T. J. (2011). Efektivitas dan Efisiensi Teknik Isolasi dan Purifikasi DNA pada Jambu Mete. Buletin RISTRI, II(2), 151-160.

Yulianti, E. (2006). Pengembangan Teknik Isolasi DNA Tumbuhan dengan Menggunakan Deterjen Komersial. Yogyakarta: Universitas Negeri Yogyakarta.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Komentar

Postingan populer dari blog ini

Potensial Air pada Jaringan Kentang

perkembangan embrio ayam

Laporan Regenerasi